Diagnostica del LAC - Sussidio didattico

SIEMENS Healthineers .... Diagnostica dei LAC Author | Department 1 Restricted © Siemens Healthineers, 2021 Algoritmo “teorico” per aPTT prolungato SIEMENS Healthineers ... Tempo di trombina Prolungato Normale Studi di Mixing (1 : 1; 1 : 4 ) Sospetta contaminazione da < eparina Correzione Correzione assente o incompleta V Possibile carenza fattoriale (F VIII, F IX, F XI, F XII) Presenza di inibitori V Determinazione dei singoli Fattori Testare il Lupus Anticoagulants o gli inibitori del F VIII Author | Department 2 Restricted © Siemens Healthineers, 2021 Quesito diagnostico: aPTT prolungato, perché? SIEMENS Healthineers ... aPTT di routine prolungato: = test di miscela (aggiungo plasma normale) TT, se allungato significa presenza eparina oppure test con polibrene neutralizza l’eparina ENF. Se il test si normalizza l’allungamento è dovuto ad eparina Prova d’incrocio con plasma normale Normale Allungato Rischio Trombotico Carenza Fattori PRESENZA LAC INIBITORI SPECIFICI Rischio Emorragico Author | Department 3 Restricted © Siemens Healthineers, 2021 LAC: definizione e scopi diagnostici SIEMENS Healthineers ... L'anticoagulante lupico è una immunoglobulina (IgG, IgA, IgM) che si lega ai fosfolipidi e alle proteine poste sulla membrana cellulare. Anticoagulante lupico è un termine improprio in quanto è in realtà un agente protrombotico. La presenza dell'anticoagulante lupico favorisce quindi in vivo la formazione di trombi. Il nome «anticoagulant» deriva dalla loro proprietà in vitro, dove la presenza di questi anticorpi provoca un allungamento dell‘aPTT, per cui si è ipotizzato che la presenza degli anticorpi interferisca con i fosfolipidi utilizzati per indurre la coagulazione in vitro. Il test LA può essere utilizzato come supporto alla definizione delle cause di:  Formazione inspiegabile di coaguli (trombosi) nelle vene e nelle arterie  Aborti spontanei ricorrenti  aPTT prolungato inspiegabile  Il test LA aiuta a determinare se l’allungamento del PTT è dovuto alla presenza di inibitori specifici della coagulazione, come autoanticorpi diretti contro i fattori della coagulazione, o non specifici come quelli del LA  Insieme alla ricerca degli anticorpi anticardiolipina (aCL) e anti β2GPI, per la diagnosi della APS.  Insieme ai test per il fattore V Leiden o della proteina C e S, come supporto alla diagnosi di patologie dovute ad ipercoagulazione (trombofilia).  Per determinare se il LA è temporaneo o persistente. Author | Department 4 Restricted © Siemens Healthineers, 2021 SIEMENS Sindrome da antifosfolipidi Healthineers .... Lupus Anticoagulants Lupus anticoagulant (LA) is one of the three laboratory criteria for LAC the identification of the antiphospholipid syndrome (APS).1,2 LA de- tection is based on phospholipid (PL)-dependent coagulation tests, A which complicate the methodology and hamper its interpretation Anticorpi anti aCL because of interference, for instance by anticoagulant therapy and LAC P cardiolipina some acute phase response proteins.3+ LA is the best-established risk factor for APS-related clinical manifestations3.º Therefore, ac- aCL aß2GPI S curate assessment of LA is essential for diagnosis and management of APS patients. External quality assessment exercises still show high Anticorpi anti b2- rates of false-positive or false-negative results. OL The analysis of glicoproteina I LA therefore remains complex, with many pitfalls in the implemented procedure, including the preanalytical conditions and interpretation.9 ab2GPI Author | Department 5 Restricted © Siemens Healthineers, 2021 LAC: test SIEMENS Healthineers .... Il test del Lupus Anticoagulant (LA) ricerca autoanticorpi prodotti erroneamente dal sistema immunitario in grado di riconoscere ed attaccare le cellule del proprio organismo. Questi autoanticorpi sono diretti contro i fosfolipidi o proteine associate con fosfolipidi esposte sulla superficie delle cellule (membrana cellulare). Il meccanismo con il quale questi anticorpi interferiscono con i processi coagulativi e il motivo per cui la loro presenza aumenti il rischio di sviluppare episodi trombotici, non è ancora del tutto chiarito. Gli anticorpi del LA non possono essere misurati in maniera diretta ma esistono molteplici test utilizzabili per la loro rilevazione. Di solito la presenza di LA viene accertata tramite l’utilizzo di un pannello di test che però sono privi di standardizzazione. In presenza di LA il tempo necessario alla coagulazione in test dipendenti da reagenti contenenti fosfolipidi, risulta allungato. Per questo motivo i primi test per il LA sono di norma il PTT, il PTT LA-sensibile o il test con veleno di vipera di Russel diluito (dRVVT cioè LA1, LA2 ). La presenza o l’assenza di LA viene quindi confermata tramite esami successivi ai risultati dei test di primo livello Author | Department 6 Restricted © Siemens Healthineers, 2021 Diagnostica del Lupus Anticoagulant SIEMENS Healthineers ...  Nessun singolo test è sufficiente a diagnosticare un LAC  Non fare mai più di due test (rischio falsi positivi)  Due test basati su due principi diversi aPTT con silice come attivatore - DRVVT -  Test positivo se uno dei due test è positivo  Referto con risultati quantitativi con commento (presenza / assenza) Author | Department 7 Restricted © Siemens Healthineers, 2021 SIEMENS Step diagnostici con reagenti dedicati Healthineers ...  Test di screening Approccio diagnostico: elevata sensibilità (a bassa concentrazione di fosfolipidi) per evitare falsi negativi  Test di miscela aPTT con silice: (molto sensibile, ma poco  Test di conferma specifico) dRVVT: robusto e più specifico per rilevare LAC in pazienti ad alto rischio trombotico. aPTT silice dRVVT PK, HMWK, XII, XI, IX, VIII X, V, II, Fibrinogeno VII Fibrina Author | Department 8 Restricted © Siemens Healthineers, 2021 Quale Valutazione per tutti i test? SIEMENS Healthineers ... Test di screening LAC (dRVVT – aPTT silice) Alterato TT per escludere UH Per tutti i test l’espressione consigliata Test di miscela è in Ratio sulla base del risultato in secondi di un Pool. Va aggiunto in Normale Alterato ogni seduta il dosaggio di un Pool normale per ogni singolo test del Carenza fattoriale Test di Conferma pannello. Alterato Normale Inibitore Fattori Diagnosi LAC I risultati sono considerati positivi quando i tempi di coagulazione sono più lunghi o la Ratio è maggiore del valore Cut-off stabilito per il test e calcolato al 99° percentile della distribuzione normale (SSC2009) Author | Department 9 Restricted © Siemens Healthineers, 2021 Ratio, Indice di Rosner o ICA, % Correzione SIEMENS Healthineers .... Tempo dello Screening o della Miscela o della Conferma sec. RATIO = Tempo del Pool normale sec. Screening Ratio - Conferma Ratio % Correzione = X 100 Screening Ratio Tempo della miscela sec. – Tempo del Pool normale sec. Indice di Rosner = X 100 (ICA) Tempo del paziente sec. Author | Department 10 Restricted © Siemens Healthineers, 2021 Area of ISTH 2009 BCSH 2012 CLSI 2014 LAC: lineeguida a confronto recommendation Sample preparation Double centrifugation Double centrifugation Double centrifugation Assays to use dRVVT and aPTT dRVVT plus aPTT or dRVVT and aPTT and/or others others Testing order Screen-mix-confirm Screen-mix-confirm Screen-confirm-mix OFFICIAL COMMUNICATION OF THE SSC Ratio derivation NPP denominator NPP denominator RI mean denominator Update of the guidelines for lupus anticoagulant detection RI/cutoffs 99th percentile 97.5th percentile (if 97.5th percentile (if V. PENGO, * A. TRIPODI,+ G. REBER, + J. H. RAND, S T. L. ORTEL, M. ** PG DE GROOT++ Gaussian) Gaussian) *Clinical Cardiology, Thrombosis Center, University Hospital, Padova; +Angelo Bianchi Bonomi Haemophilia and Thrombosis Centre, University and IRCCS Maggiore Hospital, Mangiagalli and Regina Elena Foundation, Milan, Italy; ¿Haemostasis Unit, Division of Angiology and Haemostasis, University Hospital, Geneva, Switzerland; $Hematology and Advanced Coagulation Laboratory, Montefiore Medical Center, Bronx, Calculations for % correction of screen % correction of screen % correction of screen by NY; [Division of Hematology, Duke University Medical Center, Durham, NC, USA; ** Department of Hematology, Ospedali Riuniti, Bergamo, phospholipid- by confirm, or by confirm, or confirm, or Italy; and ttDepartment of Clinical Chemistry and Haematology, University Medical Centre, Utrecht, the Netherlands dependence LA ratio LA ratio LA ratio (screen/confirm) screen/confirm) screen/confirm) CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS Mixing test Perform on 1:1 mixture |Perform on 1:1 mixture Perform on 1:1 mixture with INSTITUTE* April 2014 with NPP; with NPP NPP: Interpret with ICA or Interpret with ICA or mixing H60-A mixing test-specific test-specific cutoff cutoff Laboratory Testing for the Lupus Anticoagulant; Approved Guideline Testing patients on VKAs |Undiluted plasma if INR |Screen and confirm on Screen and confirm on 1:1 < 1.5; 1:1 mixture with NPP; mixture with NPP; Mix with NPP if INR > TSVT + ET or PNP TSVT + ET or PNP 1.5 < 3.0 Guidelines on the investigation and management of antiphospholipid syndrome Testing patients on UFH Interpret with caution Not recommended Can detect LA in some cases where heparin neutralizer is effective David Keeling,' Ian Mackie,2 Gary W. Moore, " Ian A. Greer," Michael Greaves' and British Committee for Standards in Haematology "Oxford Haemophilia and Thrombosis Centre, Churchill Hospital, Oxford, UK, Haemostasis Research Unit, Haematology Depart- Interpretive reporting Recommended Recommended Recommended ment, University College London, London, UK, "Centre for Haemostasis and Thrombosis, GSTS Pathology, Guy's & St. Thomas" Hospitals, London, UK, "University of Liverpool, Liverpool, UK and >School of Medicine & Dentistry, University of Aberdeen, Aberdeen, UK Abbreviations: aPTT, activated partial thromboplastin time; BCSH, British Committee for Standards in Haematology; CLSI, Clinical and Laboratory Standards Institute; dRVVT, dilute Russell viper venom time; ET, Ecarin time; ICA, index of circulating anticoagulant; INR, international normalized ratio; ISTH, International Society on Thrombosis and Haemostasis; LA, lupus anticoagulant; NPP, normal pooled plasma; PNP, platelet neutralization procedure; RI, reference interval; TSVT, Taipan snake venom time; Author | Department 11 UFH, unfractionated heparin; VKA, vitamin K antagonist. Restricted © Siemens Healthineers, 2021 LAC raccomandazioni CLSI 2014 SIEMENS Healthineers ... Abstract The International Society on Haemostasis and Thrombosis (ISTH) and the British Committee for Standards in Haematology (BCSH) have recently updated their lupus White Paper anticoagulant (LA) detection guidelines. The Clinical and Laboratory Standards Institute New CLSI Guideline on Testing for Lupus Anticoagulant (LA): What is (CLSI) subsequently published its first LA guideline. General agreement exists on issues Different from the SSC Guideline? such as sample preparation, the use of dilute Russell viper venom time (dRVVT) in diagnostic repertoires, the use of normalized ratios, calculations to demonstrate Dr. Carola Wagner and Dr. Thomas Wissel, Siemens Healthcare Diagnostics Products Gmbh, Marburg, Germany phospholipid dependence, calculations to demonstrate inhibition, and interpretive reporting. The ISTH recommendation to employ only dRVVT and activated partial Recent Guidelines and Recommendations for thromboplastin time is not mirrored in the BCSH and CLSI documents. The potential for Laboratory Detection of Lupus Anticoagulants false negatives in mixing tests is acknowledged by all panels, yet they remain mandated Gary W. Moore, BSC, DBMS, CSci, FIBMS, CBiol, MSB, CertMHS1 by ISTH as there are occasions when they are crucial to diagnostic accuracy. BCSH indicates that a negative mixing test need not exclude the presence of a LA, and CLSI Keywords reprioritizes test order to screen-confirm-mix, the latter being considered unnecessary lupus anticoagulants in specific circumstances. Opinions in the guidelines differ on setting cutoff levels (i.e ., > guidelines 97.5th vs. 99th percentile for normally distributed data). All guidelines cover testing of ~ dilute Russell viper anticoagulated patients, more detail being given by BCSH and CLSI, who suggest that venom time Taipan snake venom time is a useful adjunct test in patients receiving vitamin K activated partial antagonists. Although complete agreement is not apparent, the guidelines represent thromboplastin time significant moves toward engendering common practices. Author | Department 12 Restricted © Siemens Healthineers, 2021 ISTH Linee guida SIEMENS Healthineers .... Journal of Thrombosis and Haemostasis, 7: 1737-1740 DOI: 10.1111/j.1538-7836.2009.03555.x OFFICIAL COMMUNICATION OF THE SSC communication. A new paragraph is dedicated to the patient Update of the selection, and aims to minimize inappropriate requests for LA testing. Modalities for blood collection and processing are fully :ction V. PENGO, * A. TRIPOD delineated and the choice of tests is limited to dRVVT and a i. DE GROOT++ *Clinical Cardiology, Thrombosi: sensitive aPTT. Calculation of cut-off values for each diagnostic Isis Centre, University and IRCCS Maggiore Hospital, A step are clearly stated. A final Haemostasis, University Hospital paragraph reports the giology and interpretation of the results in general and in particular ledical Center, Bronx, NY; "Division of Hematology, D ali Riuniti, Bergamo, Italy; and ++Department of Clini situations. Author | Department 13 Restricted © Siemens Healthineers, 2021 Recent Guidelines and Recommendations for Laboratory Detection of Lupus Anticoagulants SIEMENS Healthineers Gary W. Moore, BSc, DBMS, CSci, FIBMS, CBiol, MSB, CertMHS1 Area of recommendation ISTH 2009 BCSH 2012 CLSI 2014 Sample preparation Double centrifugation Double centrifugation Double centrifugation Assays to use dRVVT and aPTT dRVVT plus aPTT or others dRVVT and aPTT and/or others Testing order Screen-mix-confirm Screen-mix-confirm Screen-confirm-mix Ratio derivation NPP denominator NPP denominator RI mean denominator RI/cutoffs 99th percentile 97.5th percentile (if Gaussian) 97.5th percentile (if Gaussian) Calculations for % correction of screen by % correction of screen by % correction of screen by phospholipid-dependence confirm, or confirm, or confirm, or LA ratio (screen/confirm) LA ratio (screen/confirm) LA ratio (screen/confirm) Mixing test Perform on 1:1 mixture with NPP: Perform on 1:1 mixture Perform on 1:1 mixture Interpret with ICA or with NPP with NPP: mixing test-specific cutoff Interpret with ICA or mixing test-specific cutoff Testing patients on VKAs Undiluted plasma if INR < 1.5; Screen and confirm on Screen and confirm on 1:1 Mix with NPP if INR > 1.5 < 3.0 1:1 mixture with NPP: mixture with NPP; TSVT + ET or PNP TSVT + ET or PNP Testing patients on UFH Interpret with caution Not recommended Can detect LA in some cases where heparin neutralizer is effective Interpretive reporting Recommended Recommended Recommended Abbreviations: aPTT, activated partial thromboplastin time; BCSH, British Committee for Standards in Haematology, CLSI, Clinical and Laboratory Standards Institute; dRWT, dilute Russell viper venom time; ET, Ecarin time; ICA, index of circulating anticoagulant; INR, international normalized ratio; ISTH, International Society on Thrombosis and Haemostasis; LA, lupus anticoagulant, NPP, normal pooled plasma; PNP, platelet neutralization procedure; RI, reference interval; TSVT, Taipan snake venom time; Author | Department 14 UFH, unfractionated heparin; VKA, vitamin K antagonist. Restricted © Siemens Healthineers, 2021 Raccomandazioni ISTH SIEMENS Healthineers .. Table 1 Recommendations for the optimal laboratory detection of lupus Table 2 Cut-off values for lupus anticoagulant (LA) detection* Isth anticoagulant (LA)* Cut-off values (A) Blood collection 1. Blood collection before the start of any anticoagulant drug or a Screening test International Society o Thrombosis and Haemostasis sufficient period after its discontinuation How should this De determined 2. Fresh venous blood in 0.109 M sodium citrate 9:1 1. Perform testing on plasmas from healthy donors 3. Double centrifugation 2. Take the cut-off as the value above the 99th percentile of the 4. Quickly frozen plasma is required if LA detection is postponed distribution 5. Frozen plasma must be thawed at 37 ºC Interpretation B) Choice of the test 1. Results of screening tests are potentially suggestive of LA when . Two tests based on different principles their clotting times are longer than the local cut-off value 2. dRVVT should be the first test considered Mixing test 3. The second test should be a sensitive aPTT (low phospholipids How should this be determined and silica as activator) 1. Perform testing on plasmas from healthy donors mixed with the 4. LA should be considered as positive if one of the two tests pooled normal plasma (PNP) at 1:1 proportion. Testing should gives a positive result be performed without pre-incubation within 30 min 5. For interpretation see Table 2 (screening test) 2. Take the cut-off as the value above the 99th percentile of the (C) Mixing test distribution 1. PNP for mixing studies should ideally be prepared in house. 3. Alternatively, the cut-off may be the value of the ICA defined Adequate commercial lyophilized or frozen PNP according to the equation: ICA = [(b - c)/a] x 100, where a, b can alternatively be used and c are the clotting times of the patient plasma, mixture and 2. A 1:1 proportion of patient : PNP shall be used. normal plasma, respectively [16] without preincubation within 30 min. Interpretation 3. LA can not be conclusively determined if the TT of the test 1. Results of mixing tests are suggestive of LA when their clotting plasma is significantly prolonged times are longer than the local cut-off value, or when the ICA is 4. For interpretation see Table 2 (mixing test) greater than the local cut-off value D) Confirmatory test Confirmatory test I. Connrmatory test(s) must be performed by increasing the How should this be determined concentration of PL of the screening test(s) 1. Perform testing on plasmas from healthy donors at low (screen) 2. Bilayer or hexagonal (II) phase PL should be used to increase and high (confirm) phospholipid concentration the concentration of PL. 2. Take the cut-off as the value corresponding to the mean of the 3. For interpretation see Table 2 (confirmatory test) individual % corrections calculated as defined by the equation E) Expression of results [(screen - confirm)/screen] x 100+ 1. Results should be expressed as ratio of patient-to-PNP for all Interpretation procedures (screening, mixing and confirm) 1. Results are confirmatory of LA if the % correction is above the (F) Transmission of results local cut-off value Author | Department Author | Department 15 1. A report with an explanation of the results should be given *Testing described above must be performed with the local reagent Restricted © Siemens Healthineers, 2021 Fase preanalitica SIEMENS Healthineers ...  Prelievo venoso  Trattamento del campione: centrifugazione a 2800 per 15 minuti a T. ambiente - Separazione del plasma - 2 a centrifugazione a 12000 rpm per 3-5 (per ridurre le piastrine al di - sotto di 1x109 /L)  Congelamento rapido e conservazione a -80°  Preparazione di un Pool privo di piastrine e con normale contenuto di tutti i Fattori della coagulazione e di Fibrinogeno ( per escludere processi infiammatori o infettivi in atto)  Congelato rapidamente e conservato a -80° Author | Department 16 Restricted © Siemens Healthineers, 2021 Test di screening SIEMENS Healthineers .... RACCOMANDAZIONI E LINEE GUIDA La ricerca del lupus anticoagulant: raccomandazioni del gruppo di studio sulla coagulazione di SIPMeL I test di screening devono essere eseguiti con reagenti a dRVVT Screen (Lupus Anticoagulant) bassa concentrazione di fosfolipidi per assicurare il massimo di sensibilità al LAC e come indicato in precedenza devono X essere due, un dRVVT e un aPTT (che contenga silice come dRVVT attivatore). Xa Prothrombin Screening test How should this be determined Xa 1. Perform testing on plasmas from healthy donors Va Low 2. Take the cut-off as the value above the 99th percentile of the Phospholipid Thrombin Content distribution Interpretation 1. Results of screening tests are potentially suggestive of LA when Fibrinogen Fibrin their clotting times are longer than the local cut-off value Author | Department 17 Restricted © Siemens Healthineers, 2021 Test di miscela SIEMENS Healthineers ... Nel caso il test o i test di screening risultino alterati si Interpretation devono eseguire i test di miscela. Il test di miscela serve per 1. Results of mixing tests are suggestive of LA when their clotting verificare se l'allungamento del/i test di screening è dovu- times are longer than the local cut-off value, or when the ICA is greater than the local cut-off value to a carenza di fattori o alla presenza di un inibitore (fo- sfolipide dipendente o no) e consiste nel ripetere il/i test di screening alterato/i utilizzando una miscela 1:1 tra plasma del paziente e un plasma normale entro 30 minuti (senza Plasma campione + PNP (Pool, 1:1) pre-incubazione). Come plasma normale è raccomandabile I test di miscelazione devono essere eseguiti per dimostrare la presenza di un inibitore (contro fosfolipidi o specifici per un fattore della coagulazione) ed escludere la possibile carenza di fattore Author | Department 18 Restricted © Siemens Healthineers, 2021 Test di conferma SIEMENS Healthineers ....  Si eseguono con reagenti ad elevata I test di conferma, al contrario dei test di screening, de- concentrazione di fosfolipidi per aumentare vono essere eseguiti con reagenti ad alta concentrazione di specificità fosfolipidi per aumentare la specificità. A questo scopo pos-  Si esegue con reagente che abbia lo stesso Interpretation principio usato nel test di screening 1. Results are confirmatory of LA if the % correction is above the local cut-off value  Se normalizza posso fare diagnosi di LAC alta concentrazione di fosfolipidi. Se con l'aggiunta di al- te concentrazioni di fosfolipidi il test si normalizza, si può  Se rimane alterato sono in presenza di un Inibitore non fosfolipide dipendente (es. porre diagnosi di LAC. Se invece il test di conferma risul- contro un Fattore) ta ancora alterato, ovvero l'aggiunta di alte concentrazioni di fosfolipidi non è in grado di normalizzarlo, allora si è in presenza di un inibitore non fosfolipidi dipendente (es. inibitore specifico contro un fattore coagulativo). Author | Department 19 Restricted © Siemens Healthineers, 2021 Lupus diagnostic – DRVVT Test System (LA1/LA2) SIEMENS Healthineers ... Principio: Il veleno di vipera presente nel reagente di screening LA 1 avvia la cascata coagulativa attraverso l’attivazione diretta del fattore X. Il complesso Protrombinasico (Xa + Va) con CaCl2 and PL (fosfolipidi) attiva la conversione di Protrombina a Trombina. La presenza di anticorpi LA prolunga il tempo di formazione del coagulo del reagent di screening LA 1. Il reagente di conferma LA 2 è simile al reagente di screening LA 1 ma contiene una alta concentrazione di fosfolipidi. L’eccesso di fosfolipidi contrastano gli anticorpi LA e correggono ampiamente il tempo di coagulazione. Xlla Vila/TF Composition Xla LA 1 Screening Reagent and LA 2 Confirmation Reagent contain Russell's viper venom, phospholipids, antiheparin agents, calcium, buffers, stabilizers, sodium azide and dyes. Ca **, PL IXa Xa Villa Va Ca++, PL Fibrinogen Ca *, PL lla XIlla = Fibrin Author | Department 20 Restricted © Siemens Healthineers, 2021 Lupus diagnostic – DRVVT Interpretazione (ISTH 2009) SIEMENS Healthineers ... Screen In caso di Paziente con deficienza fattoriale o in terapia OAC (deficienza congenita o acquisita): Stop 1 La miscelazione con NPP corregge il livello del Prolonged No >LA Not Detected (ABN) Fattore quindi ricduce I tempi di coagulazione Must perform second Yes test system before (correzione). making final decision Mixing Test Screen Nonostante il NPP corregga il deficit di fattore, la 1b presenza di LA influenza e prolunga il tempo di coagulazione del MixingTest dello screening. Yes Correction LA Not Detected (N) (Factor Deficiency or VKA) In caso di inibitori non-PL nel campione del No |(ABN) 2 paziente: L’inibitore non-PL ha un effetto inibitorio. Confirm I tempi di coagulazione sono prolungati. In caso presenza forte di LA: Correction No (ABN) Mixing Test Factor Assays Forte LA influisce sui tempi di coagulazione -------- 1 Confirm (use three or more dilutions) (N) bypassando l’effetto dell’aggiunta di PL. Yes No I tempi di coagulazione sono prolungati. (ABN), Inhibitor Detected 2 LA REPEAT TESTING Correction (Other or Strong LA) 21 Present in 12 weeks (N) Yes LA Present 1b Restricted © Siemens Healthineers, 2021 with Factor Deficiency Lupus diagnostic – DRVVT Interpretazione (CLSI 2014) SIEMENS Healthineers .... Screen Mixing Test Screen No Stop Yes Prolonged LA Not Detected Correction LA Not Detected (ABN) (N) (Factor Deficiency or VKA) Must perform second test system before Yes making final decision No (ABN) Confirm Mixing Test Factor Assays Confirm (use three or more dilutions) No ABN) Inhibitor Detected No (ABN) (Other or Strong LA) Correction Correction (N) (N) ---. Yes LA Present with Factor Deficiency Yes Paired Paired Paired Paired LA REPEAT TESTING Screening Confirmatory Screen Confirm Interpretation Present in 12 weeks Test Test Mixing Test Mixing Test N LA not detected ABN N LA present ABN ABN N Factor Def/VKAs 22 ABN ABN ABN N LA + Factor Def Restricted © Siemens Healthineers, 2021 ABN ABN ABN ABN Other Inhibitor or strong LA Lupus diagnostic – DRVVT Interpretazione (CLSI 2014) SIEMENS Healthineers ... Mixing Test Screen 1 In caso di Paziente con deficienza fattoriale o in terapia OAC (deficienza congenita o acquisita): La miscelazione con NPP corregge il livello del Fattore quindi Yes Correction LA Not Detected ricduce I tempi di coagulazione (correzione). (N) (Factor Deficiency or VKA) Nonostante il NPP corregga il deficit di fattore, la presenza di No |(ABN) 1b LA influenza e prolunga il tempo di coagulazione del Mixing Test MixingTest dello screening. Factor Assays Confirm (use three or more dilutions) 1 In caso di inibitori non-PL nel campione del paziente: No 2 L’inibitore non-PL ha un effetto inibitorio. (ABN) Inhibitor Detected 2 (Other or Strong LA) I tempi di coagulazione sono prolungati. Correction (N) ----. Yes LA Present In caso presenza forte di LA: with Factor Deficiency 1b Forte LA influisce sui tempi di coagulazione bypassando Paired Paired Paired Paired Screening Confirmatory l’effetto dell’aggiunta di PL. Screen Confirm Interpretation Test Test Mixing Test Mixing Test I tempi di coagulazione sono prolungati. N LA not detected ABN N LA present ABN ABN N Factor Def/VKAs ABN N LA + Factor Def Author | Department 23 ABN ABN Restricted © Siemens Healthineers, 2021 ABN ABN ABN ABN Other Inhibitor or strong LA SIEMENS Metodo DRVVT: LA1 - LA2 Healthineers ... Codice prodotti e Reagente Codice Prodotto Kit dimensioni del kit • LA 1 Screening Reagent OQGP17 10 x 2 mL • LA 2 Confirmation Reagent OQGR13 10 x 1 mL Controlli • LA Control High (OQWD) • LA Control Low (OQWE) • Control Plasma N (ORKE) Volume del Campione 100 μL campione Calibrazione n.a.  Valutazione in secondi e ratio Stabilità dopo preparazione Reagente LA1: flacone chiuso 48h 2-8°C; flacone aperto 24h a 15/25°C Reagente LA2: flacone chiuso 48h 2-8°C; flacone aperto 24h a 15/25°C Author | Department 24 Restricted © Siemens Healthineers, 2021 SIEMENS Metodo DRVVT: LA1 and LA2 Healthineers ... Valori attesi LA 1 Screening Reagent 31 – 44 secondi • LA2 Confirmation Reagent 30 – 38 secondi • Ratio LA1/LA2: 0.8 – 1.2  valore da validarsi localmente. • 𝑰𝒇 𝒓𝒂𝒕𝒊𝒐 𝑳𝑨 𝟏 𝑺𝒄𝒓𝒆𝒆𝒏𝒊𝒏𝒈 𝒊𝒔 𝒈𝒓𝒆𝒂𝒕𝒆𝒓 𝒕𝒉𝒂𝒏 𝟐. 𝟎 → 𝑳𝑨 𝒊𝒔 𝒔𝒕𝒓𝒐𝒏𝒈𝒍𝒚 𝒑𝒓𝒆𝒔𝒆𝒏𝒕 𝑳𝑨 𝟐 𝑪𝒐𝒏𝒇𝒊𝒓𝒎 𝑰𝒇 𝒓𝒂𝒕𝒊𝒐 𝑳𝑨 𝟏 𝑺𝒄𝒓𝒆𝒆𝒏𝒊𝒏𝒈 𝒊𝒔 𝒃𝒆𝒕𝒘𝒆𝒆𝒏 𝟏. 𝟓 𝒂𝒏𝒅 𝟐. 𝟎 → 𝑳𝑨 𝒊𝒔 𝒎𝒐𝒅𝒆𝒓𝒂𝒕𝒆𝒍𝒚 𝒑𝒓𝒆𝒔𝒆𝒏𝒕 𝑳𝑨 𝟐 𝑪𝒐𝒏𝒇𝒊𝒓𝒎 𝑰𝒇 𝒓𝒂𝒕𝒊𝒐 𝑳𝑨 𝟏 𝑺𝒄𝒓𝒆𝒆𝒏𝒊𝒏𝒈 𝒊𝒔 𝒃𝒆𝒕𝒘𝒆𝒆𝒏 𝟏. 𝟐 𝒂𝒏𝒅 𝟏. 𝟓 → 𝑳𝑨 𝒊𝒔 𝒘𝒆𝒂𝒌𝒍𝒚 𝒑𝒓𝒆𝒔𝒆𝒏𝒕 𝑳𝑨 𝟐 𝑪𝒐𝒏𝒇𝒊𝒓𝒎 Author | Department 25 Restricted © Siemens Healthineers, 2021 SIEMENS Metodo aPTT per lo screening Lupus Healthineers ... Il secondo metodo di screening dovrebbe essere un aPTT sensibile alla presenza di LAC (basato su silice o • Acido Ellagico) LA screening aPTT a bassa concentrazione di fosfolipidi  o Pathromtin SL (silice) o Cephen LS o Actin • FSL (Acido Ellagico) LA confirmation aPTT ad alta concentrazione  Cephen o Actin FS • Linee guida CLSI 2014 - White Paper (“Anti-phospholipid Syndrome and Testing for Lupus Anticoagulants: • Routine Approach Using Siemens aPTT Reagents”) Author | Department 26 Restricted © Siemens Healthineers, 2021 SIEMENS Lupus diagnostic – aPTT Healthineers ... I reagenti aPTT attivano la coagulazione attraverso i fattori della via intrinseca. La presenza di anticorpi LA può prolungare l’ aPTT. Xlla Actin FS, Actin FSL, Pathromtin SL Vila/TF Xla Ca **, PL IXa Xa Villa Va Ca **, PL Ca **, PL Fibrinogen XIlla lla = Fibrin Author | Department 27 Restricted © Siemens Healthineers, 2021 Screening LA usando aPTT SIEMENS Healthineers ... aPTT prolungato Tempo di Trombina Studi di Miscela normale (1:1) prolungato Correction Nessuna correzione o correzione Sospetto di contaminazione Eparinica incompleta Sospetto di carenza fattoriale Presenza di inibitori (F VIII, F IX, F XI, F XII) Conferma di Lupus o Inibitori Determnazione dei singoli fattori (FVIII ) Author | Department 28 Restricted © Siemens Healthineers, 2021 Reagenti Cephen SIEMENS Healthineers .... HYPHEN CE CEPHEN 1 LS BioMed Reagente aPTT Screening REF| CK521K www.hyphen-biomed.com IVD R1 6 x 1 mL 155, rue d'Eragny 95000 NEUVILLE SUR OISE Kit per la determinazione del tempo di coagulazione aPTT FRANCE con reagenti liquidi pronti all'uso Tel. : +33 (0) 1 34 40 65 10 Sensibile al Lupus Anticoagulant. Fax : +33 (0)1 34 48 72 36 info@hyphen-biomed.com HYPHEN BioMed Reagente aPTT Conferma CE CEPHEN 1 REF CK511K www.hyphen-biomed.com IVD R1 6 x 1 mL 155, rue d'Eragny 95000 NEUVILLE SUR OISE FRANCE Tel. : +33 (0)1 34 40 65 10 Fax : +33 (0)1 34 48 72 36 Kit per la determinazione del tempo di coagulazione aPTT info@hyphen-biomed.com con reagenti liquidi pronti all'uso Author | Department 29 Restricted © Siemens Healthineers, 2021 Take home message SIEMENS Healthineers ... Received: 30 July 2017| Accepted : 13 November 2017 DOI: 10.1002/rth2.12069 ORIGINAL ARTICLE rpth than with dAPTT alone positive. The performance characteristics Lupus anticoagulant mixing tests for multiple reagents are more sensitive if interpreted with a mixing test-specific were assessed when partnered with the LA1/LA2 dRVVT reagent cut-off than index of circulating anticoagulant pair and the total percent positivity in Cephen LS/Cephen and LA1/ Osamu Kumano PhD1 | Gary W. Moore BSc, DBMS2 LA2 pairs was 89.1%. The false positive rate in Cephen LS/Cephen samples with INR > 3.0 were included. Although these samples with could be lower than that of dRVVT assay, especially in warfarin and high INR values showed a false positive in LA1/LA2, Cephen LS/ Fll, FV deficient sample groups, and it will be useful to determine Cephen showed LA-negative results. This means that Cephen LS/ Cephen could differentiate a LA true positive from warfarin samples the cause of clotting time prolongation and differentiate LA from with high INR values without mixing tests. Taipan snake venom time other abnormal samples with a high screen ratio in an LA-sensitive reagent. The availability of convenient routine Cephen LS/Cephen reagents can facilitate rapid LA detection/exclusion in samples with an elevated APTT. Author | Department 30 Restricted © Siemens Healthineers, 2021 Algoritmo Siemens CLSI SIEMENS Healthineers .. Patient Profila www.siemens.com/diagnostics Suspicion Unaxplained of APS prolonged aPTT Laboratory Testing for Lupus Anticoagulants LA sansitivo 2FITE Screening Dado" Actin" FSL Raanant Siemens Healthcare Diagnostics suggested approach in accordance with CLSI H60-A, April 2014 Prolonged No Prolonged No LA not dalincted EHVVT confirm LA non sensitive aPIT; Confirmation With LAZ Dada Actin FS Haagant Morm Normal orratio Dodo Acum No Ratio FSLAFS Rasgant Banormal Dade Actin FSL/ Mixing Mixing study with LA1/LAZ leming stay with Llade Actin FS Reagentst Actin FSUFS Haaganta LA passant LA prosant Assay Asszy evaluation Evaluation Deda Actin LA PLAZ FSUFS Pazgants Tabla 13 Aapaat cin a second samak Author | Department 31 after a minimum of 17 weeks Restricted © Siemens Healthineers, 2021 Linee guida federazione mondiale Emofilia SIEMENS Healthineers ... Diagnosis of Hemophilia and Other Bleeding Disorders A LABORATORY MANUAL Second Edition The concentration of phospholipid varies markedly between reagents. This is one reason why reagents vary markedly in their sensitivity to the presence of lupus anticoagulants. If a lupus-sensitive reagent is used for the initial APTI, it is useful to perform a second APTT using a reagent such as Actin FS (Dade Behring, Marburg, Germany), which has a very high phospholipid concentration (Kitchen et al. 1999). If the prolongation with the first reagent is caused by lupus anticoagulant, then the second APTT is almost always normal, since very few lupus anticoagulants prolong APTT when Actin FS is used. Author | Department 32 Restricted © Siemens Healthineers, 2021 Linee guida federazione mondiale Emofilia SIEMENS Healthineers ... Diagnosis of Hemophilia likely cause. This can be confirmed later by specific tests such as dilute and Other Bleeding Disorders Russell's viper venom time (DRVVT; see Section 38), although this is not normally necessary in the absence of any requirement to investigate A LABORATORY MANUAL possible lupus anticoagulant (LAC) as a risk factor for thrombosis. Very rarely, deficiency of prekallikrein is the other possible cause of normal Second Edition APTI with Actin FS and marked prolongation of APTT with a reagent INVESTIGATION OF ISOLATED PROLONGED APTT that uses silica or kaolin as activator. Like most cases of LAC, this is not associated with any bleeding risk. Therefore, again, confirmation may not For patients with a normal prothrombin time and prolonged APTT, the normal sequence of investigation to follow is: 4 1 Determine thrombin time (see Section 15). If it is normal, proceed to steps When initial APTT is clearly prolonged (three or more seconds) and Actin 2 and 3. If thrombin time is prolonged, repeat in the presence of protamine FS APTT is normal, there is no need to perform factor assays. sulphate (see Section 16). If the thrombin time is corrected to normal, this suggests that heparin is present, and further tests below are not required. 5 If both APTIs are prolonged, perform FVIII:C, FIX, and FXI assays as If the patient is not known to be receiving heparin of any kind, a repeat required (see Section 23). A FXII assay can be performed if required, since sample should be requested. deficiency is relatively common and detection of this can then explain the prolongation of APTT. This is not necessary to exclude the presence of a 2 Determine APTT on mixtures of normal and patient plasma (see Section 14) bleeding disorder, since deficiency of FXII is not associated with increased bleeding risk. using a 1:1 (50%) mixture of normal:patient. Failure of the 50% mixture to correct the APTT to normal indicates presence of an inhibitor. 6 Reagents such as Actin FS, which employ ellagic acid as the contact 3 Determine APTT with a second reagent that contains high concentration activator, are associated with normal results in the presence of even severe phospholipids, such as Actin FS (Dade Behring). If the initial APTT deficiency of prekallikrein. is clearly prolonged (by at least three seconds over the upper limit of normal in use) and the Actin FS is normal, then lupus anticoagulant is the Where necessary, steps 1 to 3 can be performed concurrently to save time. Author | Department 33 Restricted © Siemens Healthineers, 2021 Actin FS SIEMENS Healthineers .. Reference Panel Median* 97.5th 99th White Paper Dade Actin FSL Dade Actin FSL Dade Actin FSU/ No. of samples in (97.5th perc.) mixing Dade Actin FS ratio study Interpretation Anti-phospholipid Syndrome and (97.5th perc .* ) (97.5th perc.) (total N=97) Testing for Lupus Anticoagulants: N N/A N/A 4 ** LA not detected *** Routine Approach Using Siemens AL ABN N N 0 LA not detected *** APTT Reagents Authors G. Reber, " T. Wisselt, C. Wagner' ABN ABN ABN 76 LA presente *Geneva University Hospital and Faculty of Medicine, Geneva, Switzerland Siemens Healthcare Diagnostics Products GmhH 35001 Marburg, Germany ABN N ABN 0 AFSL (sec) Weak LA suspected' ACTIN FS si allunga lievemente solo in pazienti ad elevato titolo di LAC 28.4 (LA or other inhibitor) ABN ABN N 17: AFSL Ragione aPTT prolungato e Actin FS normale Esclude le carenze di FVIII e FIX possiamo evitare di fare dosaggi inutili In carenze da FXII tra 50 - 20% ACTIN FS è spesso Può essere usato per evitare i dosaggi di fattori dato che il FXII raramente normale predispone al sanguinamento Gli anticorpi fattore specifico prolungano i tempi di coagulazione per tutti i reagenti per aPTT, ACTIN FS compreso Author | Department 34 Restricted © Siemens Healthineers, 2021 SIEMENS Healthineers .... PT 15. 7 sec 1. 26 INR 65. 7 % 1.30 LA1 111.1 sec 3.04 APTT R 78. 1 sec 2. 81 LAC aPTT 68. 8 sec 2. 26 APTT-FS R 1. 10 30. 5 Campione intero sec LA1 111. 1 sec 3. 04 LA1 MIX 88. 4 sec 2. 42 PT 13. 3 sec 1.07 INR 88. 0 % 1.10 LA2 44. 1 sec 1.31 APTT R 48. 1 sec 1. 73 LAC aPTT 68. 8 sec 2. 26 LA2 40. 0 sec 1. 19 Miscela 1:1 LAC aPTT M 54. 3 sec 1.79 APTT-FS R 0. 93 25. 7 sec Author | Department 35 Restricted © Siemens Healthineers, 2021 aPTT sensibilità per i LAC SIEMENS Healthineers ... Method comparison – Dade Actin FSL reagent versus LA 1 / LA 2 ratio Method comparison – Pathromtin SL reagent versus LA 1 / LA 2 ratio 120 120 110 110 y = 14,123x+18,801 100 100 R2 = 0,7141 90 90 - 80 80 70 70 60 y = 25,312x + 2,75 60 50 R2 = 0,7366 50 Pathromtin SL (sec) Dade Actin FSL (sec) 40 40 30 30 20 0.80 1.20 1.60 2.00 2.40 2.80 3.20 3.60 20 4.0 0.80 1.20 1.60 2.00 2.40 2.80 3.20 3.6 4.00 LA1/LA2 ratio LA1/LA2 ratio  La sensibilità al LAC degli aPTT non dipende dall’attivatore! Author | Department 36 Restricted © Siemens Healthineers, 2021 Area of ISTH 2009 BCSH 2012 CLSI 2014 LAC: lineeguida a confronto recommendation Sample preparation Double centrifugation Double centrifugation Double centrifugation Assays to use dRVVT and aPTT dRVVT plus aPTT or dRVVT and aPTT and/or others others Testing order Screen-mix-confirm Screen-mix-confirm Screen-confirm-mix OFFICIAL COMMUNICATION OF THE SSC Ratio derivation NPP denominator NPP denominator RI mean denominator Update of the guidelines for lupus anticoagulant detection RI/cutoffs 99th percentile 97.5th percentile (if 97.5th percentile (if V. PENGO, * A. TRIPODI,+ G. REBER, + J. H. RAND, S T. L. ORTEL, M. ** PG DE GROOT++ Gaussian) Gaussian) *Clinical Cardiology, Thrombosis Center, University Hospital, Padova; +Angelo Bianchi Bonomi Haemophilia and Thrombosis Centre, University and IRCCS Maggiore Hospital, Mangiagalli and Regina Elena Foundation, Milan, Italy; ¿Haemostasis Unit, Division of Angiology and Haemostasis, University Hospital, Geneva, Switzerland; $Hematology and Advanced Coagulation Laboratory, Montefiore Medical Center, Bronx, Calculations for % correction of screen % correction of screen % correction of screen by NY; [Division of Hematology, Duke University Medical Center, Durham, NC, USA; ** Department of Hematology, Ospedali Riuniti, Bergamo, phospholipid- by confirm, or by confirm, or confirm, or Italy; and ttDepartment of Clinical Chemistry and Haematology, University Medical Centre, Utrecht, the Netherlands dependence LA ratio LA ratio LA ratio (screen/confirm) screen/confirm) screen/confirm) CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS Mixing test Perform on 1:1 mixture |Perform on 1:1 mixture Perform on 1:1 mixture with INSTITUTE* April 2014 with NPP; with NPP NPP: Interpret with ICA or Interpret with ICA or mixing H60-A mixing test-specific test-specific cutoff cutoff Laboratory Testing for the Lupus Anticoagulant; Approved Guideline Testing patients on VKAs |Undiluted plasma if INR |Screen and confirm on Screen and confirm on 1:1 < 1.5; 1:1 mixture with NPP; mixture with NPP; Mix with NPP if INR > TSVT + ET or PNP TSVT + ET or PNP 1.5 < 3.0 Guidelines on the investigation and management of antiphospholipid syndrome Testing patients on UFH Interpret with caution Not recommended Can detect LA in some cases where heparin neutralizer is effective David Keeling,' Ian Mackie,2 Gary W. Moore, " Ian A. Greer," Michael Greaves' and British Committee for Standards in Haematology "Oxford Haemophilia and Thrombosis Centre, Churchill Hospital, Oxford, UK, Haemostasis Research Unit, Haematology Depart- Interpretive reporting Recommended Recommended Recommended ment, University College London, London, UK, "Centre for Haemostasis and Thrombosis, GSTS Pathology, Guy's & St. Thomas" Hospitals, London, UK, "University of Liverpool, Liverpool, UK and >School of Medicine & Dentistry, University of Aberdeen, Aberdeen, UK Abbreviations: aPTT, activated partial thromboplastin time; BCSH, British Committee for Standards in Haematology; CLSI, Clinical and Laboratory Standards Institute; dRVVT, dilute Russell viper venom time; ET, Ecarin time; ICA, index of circulating anticoagulant; INR, international normalized ratio; ISTH, International Society on Thrombosis and Haemostasis; LA, lupus anticoagulant; NPP, normal pooled plasma; PNP, platelet neutralization procedure; RI, reference interval; TSVT, Taipan snake venom time; Author | Department 37 UFH, unfractionated heparin; VKA, vitamin K antagonist. Restricted © Siemens Healthineers, 2021 Received: 6 June 2020 Accepted: 31 July 2020 DOI: 10.1111/jth.15047 SIEMENS RECOMMENDATIONS AND GUIDELINES jth Healthineers ... Guidance from the Scientific and Standardization Committee for lupus anticoagulant/antiphospholipid antibodies of the International Society on Thrombosis and Haemostasis Update of the guidelines for lupus anticoagulant detection and interpretation Katrien M. J. Devreese1,2 | Philip G. de Groot3 | Bas de Laat3 | Doruk Erkan4 Abstract Emmanuel J. Favaloro5 | lan Mackie6 | Marta Martinuzzo7 | Thomas L. Ortel8,9 This guidance focuses on methodological aspects of lupus anticoagulant (LA) test- Vittorio Pengo10 | Jacob H. Rand11 | Armando Tripodi12,13 | Denis Wahl14,15 (D Hannah Cohen16,17 (D ing, as well as interpretation of results for clinicians. The main changes in how to test for LA compared with the International Society on Thrombosis and Haemostasis Scientific and Standardization Committee 2009 guidelines, in the preanalytical phase are more detailed recommendations on how to handle testing in anticoagulated pa- tients, and the timing of testing. Also, routine coagulation tests are advised to obtain more information on the coagulation background of the patient, and when necessary, anti-Xa activity measurement for heparins or specific assays for direct oral anticoagu- lants should be performed. The three-step procedure with two test systems (diluted Russell's viper venom time and activated partial thromboplastin time [aPTT]) is es- sentially not changed. Silica remains the preferable activator in the aPTT assays, but ellagic acid is not excluded. We advise simultaneous performance of the mixing and confirmatory step, in each sample with a prolonged screening test. The confirmatory Linee Guida ISTH 2020 step can also be performed on a mixture of patient plasma and normal pooled plasma. Cutoff values should be established in-house on at least 120 normals, with transfer- ence of the manufacturer's cutoffs as an alternative. Reporting of results has not been changed, although more attention is focused on what clinicians should know. Patient selection for LA testing has been expanded. Author | Department 38 Restricted © Siemens Healthineers, 2021 Confronto: ISTH 2009 vs ISTH 2020 SIEMENS Healthineers ... Raccomandazioni Linee Guida ISTH – SSC 2009 Raccomandazioni 2020 aggiunte/cambiate rispetto a LG 2009 Raccolta campione/Fattori preanalitici Blood collection before the start of any anticoagulant drug or • Quando possibile, il campione per LA deve essere raccolto in a sufficient period after its discontinuation The effect of DOAC is unknown pazienti non in trattamento con alcun tipo di anticoagulante • Se possibile interrompere brevemente DOAC, il test LA deve essere eseguito solo dopo averne controllato la concentrazione • Considerare assorbimento DOAC (es. in pazienti con problemi renali) • Obbligatorio aggiungere info sullo stato di anticoagulazione del paziente nella richiesta Acute phase reactants such as FVIII may be increased during • Tenere presente che parametri della fase acuta (FVIII e CRP) acute events possono dare risultati LA falsi negativi / falsi positivi • Il rilevamento di LA durante eventi tromboembolici acuti deve essere interpretato con cautela poiché i pazienti possono essere trattati con dosi complete di UFH, EBPM e / o VKA Author | Department 39 Restricted © Siemens Healthineers, 2021 Confronto: ISTH 2009 vs ISTH 2020 SIEMENS Healthineers ... Raccomandazioni Linee Guida ISTH – SSC 2009 Raccomandazioni 2020 aggiunte/cambiate rispetto a LG 2009 • I test durante la gravidanza possono portare a risultati falsi positivi / falsi negativi e devono essere interpretati con cautela e ripetuti in un momento appropriato dopo il parto, dopo almeno 6 settimane e idealmente dopo 3 mesi, per ottenere risultati LA affidabili • Evitare test su campioni emolizzati • Sangue venoso raccolto in 0,109 mol / L di citrato di sodio 9: 1 • Doppia centrifugazione a 2000g per 15’ a T ambiente per ottenere un plasma povero di piastrine • Quickly frozen plasma is required if LA detection is postponed Congelare il plasma entro 4 ore dalla raccolta se l’esecuzione del LA viene posticipata • Il plasma congelato deve essere scongelato a 37 ° C per 5 minuti a bagnomaria a 37 ° C per immersione totale e quindi miscelato prima del test • Evitare cicli di congelamento / scongelamento Author | Department 40 Restricted © Siemens Healthineers, 2021 Confronto: ISTH 2009 vs ISTH 2020 SIEMENS Healthineers ... Raccomandazioni Linee Guida ISTH – SSC 2009 Raccomandazioni 2020 aggiunte/cambiate rispetto a LG 2009 Scelta del Test/Procedura del test Thrombin time (TT) will help to identify heparin Il tempo di protrombina (PT) / INR, il tempo di tromboplastina • parziale attivata (aPTT), il TT e il Fibrinogeno devono essere eseguiti per informazioni di base sullo stato anticoagulante o sulla coagulopatia • Misurare l'attività anti-FXa insieme al test LA in pazienti noti per essere in EBPM o UFH Taipan (Textarin)/Ecarin clotting times or integrated tests • I test Taipan / Ecarina sono meno influenzati dagli AVK e dai DOAC (ie %correction for APTT, SCT, and dRVVT at low and high phospholipid concentration) are not currently recommended anti-FXa. as they require further critical evaluation • Le raccomandazioni per il loro uso generale attendono la fornitura di prove indipendenti da studi collaborativi con kit standardizzati. • La diluizione del plasma del paziente in PNP non è una soluzione In VKA-treated patients: if the INR is between 1.5 and <3.0, a 1:1 dilution of patient plasma and PNP can be considered affidabile nei pazienti in trattamento con VKA (possono verificarsi risultati LA falsi negativi o falsi positivi) • Sebbene nei pazienti trattati con AVK (INR <3.0) il test LA sia sconsigliato, se tentato, i risultati devono essere interpretati con Author | Department 41 attenzione Restricted © Siemens Healthineers, 2021 Confronto: ISTH 2009 vs ISTH 2020 SIEMENS Healthineers ... Raccomandazioni Linee Guida ISTH – SSC 2009 Raccomandazioni 2020 aggiunte/cambiate rispetto a LG 2009 Principio del test: • Due test basati su diversi principi • dRVVT deve essere il primo test considerato The second test should be a sensitive aPTT (low phospholipids • Il secondo test dovrebbe essere un aPTT sensibile (idonea and silica as activator) composizione PL e bassa concentrazione) e preferibilmente silice come attivatore • LA dovrebbe essere considerato positivo se uno dei due sistemi di test (dRVVT e/o aPTT) dà un risultato positivo nei tre passaggi (screen-mix-confirm) Screening test con dRVVT e aPTT Screening test con dRVVT e aPTT • I test di screening vengono eseguiti con dRVVT e aPTT e sono considerati positivi se il tempo di coagulazione normalizzato viene prolungato oltre il cutoff stabilito localmente Author | Department 42 Restricted © Siemens Healthineers, 2021 Confronto: ISTH 2009 vs ISTH 2020 SIEMENS Healthineers ... Raccomandazioni Linee Guida ISTH – SSC 2009 Raccomandazioni 2020 aggiunte/cambiate rispetto a LG 2009 Test di miscela con Test di miscela con dRVVT e aPTT dRVVT e aPTT • Il PNP per gli studi di miscela dovrebbe essere idealmente preparato in casa. In alternativa può essere utilizzato un adeguato PNP commerciale liofilizzato o congelato (preparato appositamente) • Deve essere utilizzata una miscela in proporzione 1: 1 di paziente e PNP, senza preincubazione, entro 30 minuti • Viene eseguito un test di miscela con il reagente di screening se il test di screening su campione non diluito è prolungato • Il PNP deve essere ottenuto da almeno 40 donatori sani Interpretation: Interpretazione: Results of mixing test are suggestive of LA when their clotting times or the index of circulating anticoagulant are greater • I risultati del test di miscela sono indicativi di LA quando il than the local cutoff value tempo di coagulazione normalizzato è maggiore del valore di cutoff locale. Vedere anche l'interpretazione del test di conferma Author | Department 43 Restricted © Siemens Healthineers, 2021 Confronto: ISTH 2009 vs ISTH 2020 SIEMENS Healthineers ... Raccomandazioni Linee Guida ISTH – SSC 2009 Raccomandazioni 2020 aggiunte/cambiate rispetto a LG 2009 Test di conferma con Test di conferma con dRVVT e aPTT dRVVT e aPTT • I test di conferma devono essere eseguiti aumentando la concentrazione di PL utilizzati nei test di screening • Per aumentare la concentrazione di PL, è necessario utilizzare PL a doppio strato o esagonali. Confirmatory test is performed if the screening test and the • Test di conferma è da eseguire se il test di screening mixing test with screening reagent suggest LA presence suggerisce la presenza di LA, indipendentemente dal risultato del test di miscelazione con il reagente di screening. • Il test di conferma viene eseguito su una miscela di 1: 1 PP e PNP se il tempo di coagulazione di conferma è prolungato Interpretazione • Per i test combinati viene calcolato il Rapporto LA (screen / conferma) espresso come rapporto normalizzato • La Percentuale di correzione [(screen - conferma) / screen × 100] • Alcuni dei test integrati sono progettati per misurare una differenza nei tempi di coagulazione su una miscela di plasma [(Miscela – PNP) / Campione *100] = Indice di Rosner Author | Department 44 Restricted © Siemens Healthineers, 2021 Confronto: ISTH 2009 vs ISTH 2020 SIEMENS Healthineers ... Raccomandazioni Linee Guida ISTH – SSC 2009 Raccomandazioni 2020 aggiunte/cambiate rispetto a LG 2009 Mean value of the percentage correction for the confirmation • I risultati sono suggestivi di LA se il rapporto LA (screen / step on 40 normals conferma) o la Percentuale di correzione è superiore al 99 ° centile. • Se il test di conferma su plasma intero (screen / conferma) è prolungato, il rapporto LA normalizzato deve essere calcolato in base al risultato del Rapporto tra test screen e di conferma su una miscela di NPP 1: 1 e plasma del paziente (miscela screen / miscela conferma) e considerato positivo se sopra il 99 ° centile Espressione dei risultati • I risultati devono essere espressi come rapporto tra plasma paziente e PNP eseguito in parallelo con il plasma campione per tutte le procedure (screening, miscela e conferma) Author | Department 45 Restricted © Siemens Healthineers, 2021 Confronto: ISTH 2009 vs ISTH 2020 SIEMENS Healthineers ... Raccomandazioni Linee Guida ISTH – SSC 2009 Raccomandazioni 2020 aggiunte/cambiate rispetto a LG 2009 Valori di cutoff • Non usare valori di cutoff stabiliti altrove 99th percentile on 40 normal donors for screening and mixing • Usa valori di cutoff calcolati in casa test • Calcola il 99 ° centile su almeno 120 campioni normali con rilevamento dei valori anomali per tutti i rapporti normalizzati • In alternativa, è possibile usare i cutoff forniti dal produttore dopo verifica, se i produttori forniscono valori di cutoff stabiliti in conformità con le linee guida e con modelli statistici appropriati utilizzando una popolazione di donatori sufficientemente ampia Problemi Problemi postanalitici postanalitici È imperativo che il test venga ripetuto dopo un iniziale risultato positivo in una seconda occasione dopo 12 settimane • Author | Department 46 Restricted © Siemens Healthineers, 2021 Confronto: ISTH 2009 vs ISTH 2020 SIEMENS Healthineers ... Raccomandazioni Linee Guida ISTH – SSC 2009 Raccomandazioni 2020 aggiunte/cambiate rispetto a LG 2009 Refertazione efertazione • LA viene refertato con una conclusione finale Positivo / Negativo • Commenti come LA borderline o dubbio sono altamente scoraggiati e in questi casi il commento dovrebbe essere "suggerire un nuovo test dopo una settimana o più", senza suggerire LA positivo o negativo • Insieme ai risultati analitici per le tre fasi (Screen, Mix, Confirm), devono essere riportati i cutoff locali • Dovrebbe essere fornito un referto con una spiegazione dei risultati • I risultati dovrebbero sempre essere correlati ai risultati di aCL e aβ2GPI per valutare il profilo di rischio • I risultati dovrebbero essere interpretati in un contesto clinico e con conoscenza del trattamento in corso • Anche le informazioni fornite nella richiesta sullo stato anticoagulante del paziente devono essere incorporate nel referto È essenziale una stretta interazione tra il laboratorio e il clinico • Author | Department 47 Restricted © Siemens Healthineers, 2021 Esempio di referto SIEMENS Healthineers ... P - Ricerca LUPUS ANTICOAGULANT (LAC) Ricerca LAC POSITIVA * aPTT (att. Silice): Ratio del Plasma Paziente 2,32 Fino a 1.25 aPTT (att. Silice): Ratio del Plasma Mix 1,75 Fino a 1.25 aPTT(att. Silice): Ratio test di conferma ,46 [0,70 - 1,25] aPTT (att. Silice): Ratio normalizzata 1,59 [0,70 - 1,25] aPTT (att. Silice): esito del Test POSITIVO Negativo RATIO del test di screening 2,38 Fino a 1.25 - RVV (Russel Viper Venon): Ratio del Plasma Mix 1,63 Fino a 1.25 RVV (Russel Viper Venon): esito dello Screening POSITIVO Negativo RVV (Russel Viper Venon): Ratio Test di Conferma 1,24 Fino a 1,25 RVV (Russel Viper Venon): Ratio Normalizzata 1,92 Fino a 1.25 RVV (Russel Viper Venon): esito del Test POSITIVO Author | Department 48 Restricted © Siemens Healthineers, 2021 Esempi di refertazione SIEMENS Healthineers ... P - Ricerca LUPUS ANTICOAGULANT (LAC) Ricerca LAC POSITIVA * - - --- - - aPTT (att. Silice): Ratio del Plasma Paziente 1.84 Fino a 1.25 aPTT (att. Silice): Ratio del Plasma Mix 1,32 Fino a 1.25 aPTT(att. Silice): Ratio test di conferma 1,27 [0,70 - 1,25] aPTT (att. Silice): Ratio normalizzata 1,45 [0,70 - 1,25] - aPTT (att. Silice): esito del Test POSITIVO I Negativo RATTO del test di screening 1,43 Fino a 1.25 RVV (Russel Viper Venon): Ratio del Plasma Mix 1,13 Fino a 1.25 - L RVV (Russel Viper Venon): esito dello Screening NEGATIVO I Negativo Note e commenti - - -- ----- - - -- Test di conferma è da eseguire se il test di screening ATTENZIONE: POSITIVITA' DEBOLE, DA CONTROLLARE FRA TRE MESI suggerisce la presenza di LA, indipendentemente dal risultato del test di miscelazione con il reagente di screening. Author | Department 49 Restricted © Siemens Healthineers, 2021 SIEMENS Healthineers GRAZIE Pagina ‹N› | Unrestricted © Siemens Healthcare S.r.l., 2016